#Эндогенное дыхание на Универсале-2011 с Евгением Вериго
Августа, 20, 2018, 08:18:00 am *
Добро пожаловать, Гость. Пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь.

Войти
Новости: SMF - Just Installed!
 
   Начало   Помощь Поиск Календарь Войти Регистрация  
Страниц: [1]   Вниз
  Печать  
Автор Тема: Механизмы адаптации млекопитающих к гипоксии с участием дыхательных гемопротеино  (Прочитано 3345 раз)
Евгений Вериго
Moderator
Full Member
*****

Karma: +0/-0
Offline Offline

Сообщений: 246


Куйбышевский ВМФ - выпуск 1983 года


Просмотр профиля Email
« : Мая, 15, 2015, 20:19:02 pm »

Тема автореферата диссертации: Механизмы адаптации млекопитающих к гипоксии с участием дыхательных гемопротеинов

Источник: Автореф. дис. д-ра биол. наук: 03.00.04 / В.Н. Коробов; НАН Украины. Ин-т биохимии им. О.В.Палладина. — К., 2003. — 29 с.: рис. — укр.

Аннотация

 Проведено сравнительное исследование структурно-функциональных характеристик дыхательных гемопротеинов крови и мышц вторичноводных амниот, способных прекращать внешнее дыхание на продолжительный срок, и наземных млекопитающих. Показано, что в процессе освоения животными новых экологических ниш в составе миоглобина происходило закрепление таких аминокислотных замещений, которые обусловливают его высокую растворимость и возможность накопления миоглобина в миоците без угрозы кристаллизации, не нарушают структуры гидрофобного ядра, что является необходимым условием сохранения пространственной организации миоглобина.

 Установлено, что коррекция функциональных сдвигов в кислородно-транспортной, кислородутилизирующей и антиоксидантной системах при условиях гипоксии дипептидом карнозином обусловлена его способностью нормализовать прооксидантно-антиоксидантное равновесие, корригировать окислительное фосфорилирование в митохондриях и устранять функциональные нарушения в цикле оксида азота.  

Механизмы адаптации млекопитающих к гипоксии
с участием дыхательных гемопротеинов

Актуальность темы

Выяснение влияния гипоксии на организм человека и животных является важной проблемой в биологии и медицине, которая приобретает особую актуальность, учитывая то, что состояние гипоксии сопровождает много заболеваний, а также в связи с необходимостью учёта этого феномена при научно обусловленном целенаправленном поиске эффективных антигипоксантов. (Или же - в поиске эффективных методов адаптации к гипоксии. Быстрых и неодолимых. - Е.В.)

Интерес к гипоксии и необходимость чёткой характеристики её проявления появились давно, но, при всех имеющихся достижениях, наука продвинулась в понимании механизмов развития гипоксии недостаточно глубоко, и до сих пор не решены проблемы адаптации организма к недостатку кислорода, а также предупреждение гипоксического состояния тканей и органов. (Вот эта-то гипоксия - тканей и органов - является патологической. А альвеолярная гипоксия, да ещё и в - лёгкой степени, кратковременная - оздоравливает людей, занимающихся эндогенным дыханием на Универсале-2011. Принцип гомеопатии - "Подобное лечится подобным" - торжествует. - Е.В.)

Известно, что кислородный гомеостаз реализуется комплексом систем организма, где кислородтранспортная система имеет решающее значение. Очевидно, структурно-функциональная организация дыхательных белков крови - гемоглобина (Нb) и мышц - миоглобина (Мb) в значительной мере определяет адаптивные возможности организма к недостатку кислорода.

Установление роли этих белков в адаптации к гипоксии может быть реализовано путём изучения особенностей их структурно-функциональной организации у животных, которые способны сохранять жизнь и высокую работоспособность при условиях продолжительного прекращения внешнего дыхания (бобёр, ондатра, выдра, нутрия), а также в модельных экспериментах, создавая условия недостатка кислорода в тканях и воздухе (гипоксическая, гемическая гипоксия).

Выяснение молекулярных механизмов адаптации животных к недостатку кислорода будет способствовать целенаправленному поиску эффективных средств предупреждения и коррекции гипоксических состояний, которые возникают при ряде патологий, при пребывании людей в экстремальных условиях. Этим определяется актуальность проблемы.

Проблема адаптации к недостатку кислорода до этого времени разрабатывалась преимущественно на основе модельных экспериментов с использованием традиционных объектов исследования - лабораторных животных. Почти не используются представители животного царства, естественно адаптированные к гипоксии (Сотнями и тысячами поколений, кстати. - Е.В.). Исследование механизмов адаптации в сравнительно-эволюционном аспекте даёт возможность выяснить, за счёт каких механизмов неадаптированный организм приобретает свойство адаптированного.

Для выяснения механизмов адаптации организма к гипоксии многое могут дать исследование на естественно адаптированных к дефициту кислорода животных, в том числе, на ныряющих млекопитающих, способных задерживать внешнее дыхание на значительный период, поддерживая при этом высокую работоспособность.

Ограниченность знаний о тонких механизмах изменений кислородтранспортной и антиоксидантной систем, индуцированных кислородным голоданием, является причиной дефицита терапевтических средств коррекции метаболических нарушений в организме человека. Перспективным в этом отношении может быть карнозин (β-аланин-L-гистидин), поскольку этот дипептид не является токсичным, имеет широкий спектр положительного биологического действия.

Связь работы с научными программами, планами, темами.

Работа является частью фундаментальных исследований кафедры биохимии и научно-исследовательской лаборатории молекулярной и радиационной биохимии Львовского национального университета имени Ивана Франко по темам:

 - “Изучение молекулярных механизмов адаптации к недостатку кислорода и разработка способов коррекции систем транспорта газов с целью предупреждения гипоксии тканей.” (№ гос. регистрации 0193U024093, срок выполнения: 1.01.1992-31.12.1994),

 - “Исследование механизма действия карнозина на метаболические реакции в условиях гипоксии различной этиологии.” (№ гос. регистрации 0193U024089, срок выполнения: 1.01.1992-31.12.1995),

 - “Исследование механизма действия низкомолекулярных естественных метаболитов” (№ гос. регистрации 0195U026232, срок выполнения: 1.01.1995-31.12.1997),

 -  “Исследование механизма действия карнозина в коррекции метаболических нарушений при гемической и гипоксической гипоксии.” (№ гос. регистрации 0193U024090, срок выполнения: 1.01.1992-31.12.1995),

 - “Низкомолекулярные естественные метаболиты в коррекции гипоксических состояний организма” (№ гос. регистрации 0197U018113, срок выполнения: 1.01.1997-31.12.1999), и

 - “Регуляторное действие НАД и гистидинсодержащих дипептидов в коррекции метаболических нарушений при гипоксии.” (№ гос. регистрации 0100U001443, срок выполнения: 1.01.2000-31.12.2002).

Цель и задача исследования.

Провести сравнительные исследования дыхательных гемопротеинов вторичноводных амниот, наземных млекопитающих и изучить механизмы адаптации организма к гипоксии с участием этих белков. Разработать способы коррекции функциональных нарушений систем транспорта и утилизации кислорода в условиях гипоксии.

Соответственно поставленной цели необходимо было решить такие задачи:

1 - Получить гомогенные препараты миоглобинов (Mb) и гемоглобинов (Hb) полуводных млекопитающих, человека и отдельных лабораторных животных.

2 - Провести сравнительный анализ пространственной организации Mb вторичноводных амниот и наземных млекопитающих.

3 - Исследовать физико-химические и функциональные свойства дыхательных гемопротеинов резистентных и нерезистентных к гипоксии животных.

4 - Изучить влияние гипоксических факторов на структурно-функциональные свойства дыхательных белков крови и мышц некоторых видов млекопитающих. (У профессора Тимочко было три группы животных - низкорезистентные, среднерезистентные и высокорезистентные к гипоксии. - Е.В.)

5 - Изучить влияние гипоксических факторов на экспрессию генов Mb.

6 - Исследовать влияние гипоксических факторов на состояние антиоксидантной системы и дыхание митохондрий.

7 - Изучить закономерности генерации эндогенного оксида азота в динамике адаптации к недостатку кислорода во вдыхаемом воздухе.

8 - Исследовать механизм антигипоксического действия дипептида карнозина.
 
Научная новизна полученных результатов.

В результате проведённых исследований впервые установлены особенности структурной организации Mb и Hb животных, которые способны сохранять жизнь и высокую работоспособность в условиях периодического прекращения внешнего дыхания, которое связано с погружением в воду.

Сформулированы положения о том, что решающее значение в проявлении функциональных особенностей Mb имеют замещение аминокислот, локализованных на поверхности молекулы и не вовлечённых в формирование гидрофобного ядра глобулы.

Исследованиями доказано, что в процессе эволюционного приспособления жизни животных к среде существования путём периодического погружения в воду (применительно к занятиям эндогенным дыханием на Универсале-2011 - это длительные выдохи через Универсал-2011 - Е.В.), в гемопротеинах крови и мышц происходили такие замещения аминокислот, которые привели к повышению растворимости этих белков. Это обеспечивало увеличение кислородной ёмкости за счёт возможного повышения локальной концентрации гемопротеинов в красных клетках крови и мышц без угрозы их кристаллизации.

Показано, что гипоксическая и гемическая гипоксия индуцируют компенсаторные изменения кислородсвязывающих, аутоокислительных, пероксидазных и нитритредуктазных свойств Hb. Эти изменения меньше выражены у животных, естественно адаптированных к недостатку O2 во внешней среде, по сравнению с наземными млекопитающими, что свидетельствует о закреплении естественным отбором (конечно, если данные благотворные приспособления развивались у сотен и тысяч поколений этих животных - Е.В.) предтерминированных свойств дыхательных белков, которые обеспечивают видовую резистентность к гипоксии.

Сравнительным экспериментальным анализом установлено, что между сродством Hb к О2 и количеством продуктов ПОЛ в крови есть прямая связь, которая даёт возможность рассматривать гемическую компоненту системы транспорта газов как резервное звено антиоксидантной защиты и важный фактор стабилизации прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма во время гипоксических стрессов.

Показано, что коррекция гипоксического состояния организма может осуществляться мышечным дипептидом карнозином, что солокализован с Mb и стимулирует процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях печени крыс и угнетает свободнорадикальные и перекисные процессы.

Установлено, что карнозин влияет на процессы образования нитрозо-Hb, изменяя интенсивность сигналов Hb(FeIII)- и Hb(FeII)-комплексов, а также активирует нитритредуктазный компонент цикла оксида азота (цNО) и тормозит диссоциацию комплексов NO с дыхательными гемопротеинами, чем увеличивает мощность мобильного эндогенного депо NO и предотвращает отрицательное действие оксида азота при условии его избыточного образования в случае гипоксических стрессов.

Практическое значение полученных результатов.

Полученные данные, касающиеся структурно-функциональных особенностей дыхательных белков крови и мышц животных, эволюционно приспособленных к недостатку О2, могут быть основой для целенаправленного поиска способов предупреждения развития гипоксических состояний организма. Экспериментально обоснована целесообразность использования как антигипоксанта мышечного дипептида карнозина и его комплекса с цинком.

Полученные препараты Mb использованы в научно-исследовательских работах при создании иммуносенсора для определения концентрации Mb в крови при:

- инфарктах миокарда;

- моделировании систем облегчённой диффузии кислорода (Институт биохимии НАН Украины, Киев; Институт биохимии НАН Беларуси, Гродно);

- изучении биофизических характеристик белков, облучённых ультрафиолетом (Воронежский университет, Россия);
 
- выяснении функциональных характеристик гемопротеинов в модельных системах (Медицинский институт, Гродно).

Выявленные антигипоксические свойства карнозина стали основанием для проведения комплексных исследований по изучению механизмов действия этого дипептида на базе Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, и Института нейрохирургии им. А.П. Ромоданова АМН Украины.

Результаты работы используются во время чтения курса лекций "Молекулярная биология", “Биохимия”, “Биоорганическая химия”, спецкурсов: "Структура и функции белков", “Биохимия крови” на биологическом факультете Львовского национального университета имени Ивана Франко.

Отдельные положения, которые вытекают из результатов проведённых исследований, включены в опубликованную совместно со Стародубом М.Ф. и Назаренко В.И. монографию "Миоглобин: структура, свойства, синтез, биологическая роль" (К.: Науч. мысль, 1992, 281с.).

Личный взнос соискателя.

Идея и постановка задачи принадлежат автору. Им самостоятельно проанализирован значительный объём отечественной и иностранной литературы для планирования и корректного выполнения научных экспериментов. Исследование структурно-функциональных параметров Нb и Мb млекопитающих, определение активности ферментов, содержимого отдельных метаболитов в эритроцитах и плазме крови, а также изучение влияния карнозина на физико-химические и функциональные свойства гемсодержащих белков проведён автором.

Исследование параметров дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени в норме и в динамике адаптации к гипоксии выполнены совместно с сотрудниками научно-исследовательской лаборатории кафедры физиологии человека и животных Львовского национального университета имени Ивана Франко.

Регистрация спектров ЭПР проведена совместно с кандидатом физических наук Падляком Б.В. В работе использованы результаты исследований первичной структуры Mb полуводных амниот, установленные совместно с аспирантами кафедры биохимии Дробот Л.Б., Сергиенко Л.М., Васильевой В.О., Горчаковой Г.И.

Рентгеноструктурный анализ кристаллических препаратов Mb бобра и мыши осуществлён совместно с сотрудником Института биофизики АН России (г.Пущино) Шелестовым В.М. Молекулярная гибридизация к-ДНК и миоглобиновых м-РНК проведена в отделе биосинтеза нуклеинових кислот Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины совместно с кандидатами биологических наук Петренко О.И. и Дмитренко В.В.

Публикации.


Результаты диссертации представлены в 1 монографии, 59 статьях в научных профессиональных журналах, 102 тезисах в сборниках материалов съездов, конференций и симпозиумов и 3 патентах на изобретения.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из вступления, трёх разделов (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и их обсуждение), вывода и списка использованных источников, который содержит 453 наименования. Объём работы составляет 322 страницы. Диссертация проиллюстрирована 58 таблицами и 50 рисунками.

Основное содержание работы

Обзор литературы

Систематизированы данные литературы относительно структурно-функциональных особенностей дыхательных гемопротеинов крови и мышц млекопитающих, эволюционно адаптированных к недостатку кислорода во вдыхаемом воздухе. Обобщены результаты исследований о системе транспорта O2 при кратковременной и долговременной адаптации к гипоксии. Проанализированы молекулярные механизмы взаимодействия кислородтранспортной и NO-синтазной систем в условиях гипоксических стрессов. Обработаны данные литературы относительно физиологической и биохимической роли дипептида карнозина, локализованного в миоцитах вместе с миоглобином.

Материалы и методы исследований

Эксперименты проводились на половозрелых беспородных белых крысах массой 170-200 г, которые содержались в условиях стандартного пищевого рациона. Опыты проводили также на млекопитающих, которые способны прекращать внешнее дыхание на продолжительный период, погружаясь под воду: бобре (Castor fiber L.), ондатре (Ondatra zibethica L.), выдре (Lutra lutra L.), нутрии (Myocastor coypus L). При сравнительных структурных исследованиях использовали Hb человека (Homo sapiens L.) и мыши (Мus musculus L), как предварительно охарактеризованные стандарты.

Гипоксическое состояние у исследуемых животных вызывали, выдерживая их в проточной барокамере, где создавали парциальное давление кислорода 56, 32, 28 mm Hg, что соответствует высоте над уровнем моря 7000, 9000, 11500 м, соответственно.

Гемическую гипоксию моделировали путём внутрибрюшного введения NaNO2 в дозе 50 мг/кг массы. Карнозин вводили крысам перорально в водном растворе объёмом 1 мл в дозе 70 мг/кг массы животного на протяжении девяти дней и за 24 ч до декапитации. Комплекс карнозина с Zn был получен совместно с доцентом Зегждой Г.Д. из ацетата Zn на кафедре неорганической химии Днепропетровского университета.

Mb выделяли из замороженных мышц путём высаливания белков из водных экстрактов тканей с помощью (NH4)2SO4 (Троицкая О.В, 1966). Кристаллические препараты Mb очищали с помощью ионообменной хроматографии, используя ДЕАЕ-целлюлозу, ДЕАЕ-сефадекс А-50, СМ-целлюлозу-32.

Растворимость Mb и Hb определяли по методом ступенчатого высаливания (NH4)2SO4 (Березовский В.А., 1968). Мажорные хроматографические компоненты Mb использовали для получения кристаллических препаратов при таких условиях: исходная концентрация белка - 6%, концентрация (NH4)2SO4 - 90%, буфер К-Nа-фосфатный 0.1М, рн 7.0.

Рентгенографически исследовали кристаллические препараты Mb с помощью установки "УРС-60", придерживаясь таких условий: V=38 кв, I=17 ма, экспозиция облучения – 7 ч. Профили гидрофобности полипептидных цепей Mb рассчитывали, учитывая свободную энергию переноса аминокислотных остатков из фазы конденсированного водного пара в фазу жидкой воды. Расчёт осуществляли для сегментов из семи остатков, начиная с N-, смещая к С-концу молекулы на один остаток.

Популяции эритроцитов разделяли в градиенте плотности сахарозы по Сизовой и соавт. (Сизова И.А. и др., 1980). Hb получали, гемолизируя эритроциты К-Nа-фосфатным буфером (33 мм, рн 7.3). Концентрацию Нb определяли метциангидриновым методом (Кушаковский М.С., 1968). Хроматографическое фракционирование НbО2 осуществляли, используя ионообменный сефадекс СМ-С-50.

Градиентное отщепление гема производили по Квину и Персону (Quinn J.R., Pearson A.M., 1964). Дактилографический анализ глобинов, осуществляли по Ингрему (Ingram V., 1993). Пероксидазную активность Hb и Mb определяли, используя гваякол и Н2О2 по методу Починок Х.Н. (1977) в модификации Гончара М.В. (1984). Электрофоретический анализ Hb осуществляли методом электрофореза в полиакриламидном геле.

Конформационные изменения Hb оценивали, используя антитела к отдельным хроматографическим компонентам Hb, а также краситель – кумаси ярко-голубой G-250 (Ройтруб Б.А, 1975). Концентрацию свободного и мембраносвязанного 2.3-ДФГ измеряли по pеакции с хpомотpоповой кислотой (Benesch R.E., Benesch E., 1969).

Концентрации свободного креатина в эритроцитах определения в безбелковых гемолизатах, используя цветную реакцию с диацетилом при наличии α-нафтола (Виноградова И.Л., Багрянцева С.Ю, 1983). Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по Чевари С. (1991), каталазы - по Королюку М.А. (1988). Содержание диеновых конъюгатов определяли по интенсивности поглощения конъюгированых диенових структур (Гаврилов М.И., 1983).

Уровень ТБК-позитивных продуктов - по Тимурбулатову Р.А., (1981). Концентрацию белка определяли по методу Lowry O.H., et al., (1951). Оценку кислородтранспортной функции и кислородно-щелочного равновесия крови проводили с помощью микроанализатора АП-330 (Radiometr). Показатель р50 оценивали во время смешивания и корректирования (Severinghaus J.W., 1966).

Кислородсвязывающие свойства Hb гемолизатов эритроцитов периферической крови определяли спектрофотометрически в модификации Струбицкого И.В. и др. (1988). Динамику синтеза Мb изучали спектрофотометрическим методом, следя за уровнем экспрессии миоглобинового гена с помощью гибридизации кДНК миоглобинового гена с поли-А-содержащими РНК.

Тотальную РНК выделяли из замороженных тканей гуанидинизотиоцианатным методом (Chirgwin et al., 1979). Поли-А-РНК получали фракционированием тотальной РНК на олиго-(dТ)-целлюлозе (Маниатис Т. и др., 1994).

Дыхание и окислительное фосфорилирование в митохондриях (MX) регистрировали полярографическим методом (Chance B. and Williams G.R., 1955). Среда инкубации для МХ печени содержала 150мМ сахарозу, 50 мМ KCI, 1 мМ KH2PO4, 3 мМ трис-HCI буфер, p=7.4.

Образование нитрозильных комплексов Hb фиксировали методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием радиоспектрометра типа RADIOPAN SE/X-2544 (Польша). Генерацию NO осуществляли по (Кrхnске K.D., 1996). За степенью перехода дезоксиHb в нитрозоHb следили с помощью спектрофотометра Specord UV VIS M40 (Германия).

Нитритредуктазную активность Нb и Мb регистрировали спектрофотометрически при λ=480 нм. Мембраносвязанный Нb получали из отмытых теней эритроцитов (Назаренко В.И. и соавт., 1998). Исследование кинетики диссоциации NO от нитрозоHb проводили по (Sharma V.S. et al., 1978).

Результаты исследований

Сравнительный анализ пространственной организации миоглобинов полуводных амниот и
наземных животных. Профили гидрофобности.

Анализ распределения гидрофобных кластеров в линейной цепи Mb полуводных млекопитающих в сравнении с Mb эволюционно отдалённых видов даёт возможность выяснить общие закономерности и особенности структурной организации исследуемых гемопротеидов. Представленные на рисунке 1 профили гидрофобности свидетельствуют о том, что они являются идентичными в участках наибольшей гидрофобности с центрами локализации, размещёнными над остатками 109Е и в участке дистального гистидина Е7 (64) с максимумом над остатками 69I (в Mb бобра и ондатры) и 71А (в Mb бобра и выдры).

Рис. 1. Профили гидрофобности миоглобинов кашалота (1), бобра (2), ондатры (3) и мыши (4).

Профили гидрофобности Mb ныряющих и наземных млекопитающих сохраняют максимальную степень гидрофобности в участке дистального гистидина Е7(64), что свидетельствует об однозначном характере пространственной укладки полипептидной цепи в участке гемового окружения. Несмотря на неравнозначность замещений в позиции 87 (лиз а  асп) Mb мыши, его профиль гидрофобности мало отличается от других. Высокий консерватизм в кластерном распределении гидрофобных остатков сопровождается аналогией в β-изгибах и размещении α-спиралевых участков (рис. 2).

Рис. 2. α-спиралевые участка (a) и β-изгибы (б) в миоглобинах бобра (1), ондатры (2) в срав-нении с миоглобинами кашалота (3) и мыши (4).

Установлены межплоскостные расстояния дебаевских линий дебаеграмм и параметры кристаллических решёток: a=5.98; b=2.79; c=3.23 и a=5.71; b=2.85; c=3.30 моноклинной сингонии Mb бобра и мыши соответственно.

Совокупность результатов рентгенструктурного анализа, рассчитанных профилей гидрофобности, α-спиралевости и β-изгибов даёт основание утверждать, что несмотря на значительное количество аминокислотных замещений, закреплённых естественным отбором, имеет место сохранение общей картины пространственной организации Mb эволюционно отдалённых животных.

Итак, закреплённые естественным отбором аминокислотные замещения на поверхности белковой матрицы, которая обеспечивает формирование сольватной оболочки, не нарушают консервативного распределения гидрофобного скефолда, что является необходимым условием сохранения функционально-оптимальной пространственной организации Mb.

Сравнительный анализ физико-химических и функциональных
свойств исследуемых миоглобинов

Растворимость миоглобинов.

Сравнительный анализ замещений аминокислотных остатков, расположенных на поверхности глобулы Mb, которые контактируют с молекулами воды, показал, что суммарная величина доступности боковых групп аминокислот растворителю возрастает в ряде Mb мыши→бобра→ондатры→выдры и составляет 1384.3→ 1424.1→ 1424.1 и 1419.9 соответственно, что определяет относительно высокую растворимость Mb ныряющих млекопитающих.

Высокая растворимость Mb вторичноводных амниот обеспечивает насыщение клеточного цитозоля гемопротеином без угрозы кристаллизации в миоцитах, и является предпосылкой увеличения мощности NO-редуктазного звена цNO и депонирования О2.

Влияние pН на стабильность миоглобинов.

Установлено, что Mb резистентных к нехватке O2 животных сохраняют нативность при подкислении среды до pН 4.5. Для Mb мыши и крысы это значение достигает 5.1, что свидетельствует про относительно низкую резистентность Мb нестойких к дефициту О2 животных при условиях ацидоза. Mb вторичноводных амниот сохраняют нативную конфигурацию в более кислой среде, чем Mb мыши.

Сп (значение pН, при котором в равновесной системе денатурирующих молекул половина из них находится в развёрнутом состоянии) в 0.1М фосфатном буфере для Mb мыши составляет 5.10±0.10, для Mb ондатры – 4.54±0.15, бобра и выдры – 4.45±0.10, соответственно. Суммарный вклад гидрофобности в С-конечном домене Mb бобра, ондатры, мыши, составляет 7800, 7650 и 1950 соответственно. Итак, высокая резистентность Mb вторичноводных амниот по сравнению с наземными животными определяется низкой степенью экспонированности на воду аминокислотных остатков, локализованных в С-конечном домене белковой матрицы.

Кислородосвязывающие свойства.

Полунасыщение кислородом Mb, полученных из мышц подопытных животных, происходит при рО2 в интервалах 0.50-0.52→ 0.62-0.67→ 3.2-3.5 мм рт. ст. при температуре 15, 20, 37°С соответственно. Установленные особенности оксигенации Mb в зависимости от температуры являются важным фактором формирования механизмов адаптации ныряющих млекопитающих к недостатку О2. Поскольку погружение под воду сопровождается снижением температуры тела, левосторонний сдвиг КДК Mb обеспечивает увеличение мощности О2-депонирующей компоненты системы транспорта газов.

Пероксидазная активность.

Показано, что пероксидазная активность Mb исследуемых экологических групп млекопитающих уменьшается в ряде: бобёр (0.697±0.020 мкм/сек)→выдра (0.586±0.020)→крыса (0.371±0.020)→мышь (0.298±0.010). Анализ аминокислотных замещений в области “активного центра” Mb свидетельствует о том, что два из них касаются области контакта с гемом: Thr- 67(10Э) Mb мыши замещён на Val в Mb бобра и Ile-99 (FG) также замещён на Val в Mb выдры.

Вследствие указанных замещений в Mb вторичноводных амниот суммарная гидрофобность остатков, которые формируют гемовое окружение и непосредственно контактируют с гемом из дистальной стороны, увеличивается по сравнению с Mb наземных млекопитающих. Поскольку остаток Val имеет больший объём по сравнению с Thr, то такое замещение приводит к уменьшению свободного пространства в гидрофобном кластере с дистальной стороны гема, что определяет высокую пероксидазную активность Mb животных, адаптированных к недостатку О2.

Сравнительный анализ структурно-функциональной организации
гемоглобинов резистентных и нерезистентных к гипоксии животных

Структура консерватиних участков гемоглобинов полуводных амніот.

По количеству трипсиновых и химотрипсиновых пептидов, характеру их распределения на фингерпринтах, прямой детекцией отдельных аминокислотных остатков и анализом аминокислотного состава установлена гомология в структурной организации α-цепей исследуемых Нb в следующих участках: (8-11)→ (12-16)→ (41-56)→ (57-61)→ (91-99)→ (140-141); β-цепей: (8-17)→ (31-40)→ (61-65)→ (95-103)→ (144-145).

Консерватизм в отмеченных участках обеспечивает специфику молекулярной морфологии и функций Нb. Установлено, что суммарная доступность аминокислотных остатков для растворителя увеличивается в ряде Hb: крысы→выдры→нутрии→ондатры→бобра и составляет соответственно 19991.0, 20211.0, 20274.0, 20504.2, 20650.0. Это указывает на относительно высокую растворимость Hb полуводных амниот, и является предпосылкой достижения высокой концентрации гемопротеина в эритроцитах, и как следствие, повышение кислородной ёмкости крови.

Кислородсвязывающие и квазиферментативные свойства гемоглобинов

В процессе эволюционного развития у человека и животных установился окислительный тип обмена веществ. Необходимым условием поддержания соответствующего уровня такого метаболизма является непрерывное и адекватное поступление О2 в ткани, которое обеспечивается кислородсвязывающими свойствами Нb.

Для кривых оксигенации Hb полуводных амниот характерен сдвиг в участке верхней инфлексии влево и вверх. Значение р50 находится в границах 23.5 - 26.9 mm Hg. Экстраполяция экспериментальных значений log р50 на кривую зависимости сродства Hb к О2 от логарифма массы тела животного свидетельствует о том, что Hb ныряющих животных имеет относительно большее сродство к О2, чем Hb наземных млекопитающих. Это обеспечивает максимальное насыщение крови кислородом при энергичном дыхании животных перед погружением в воду и способствует равномерной отдаче О2 тканям во время продолжительного пребывания под водой.

Структурно-функциональная организация
хроматографичиских фракций гемоглобинов.

 Хроматографические фракции Hb вторичноводных амниот и наземных животных отличаются по аминокислотному составу, дактилограммами трипсиновых и химотрипсиновых гидролизатов глобинов, значениями эквивалентных точек преципитации, прочностью порфирин-глобиновых связей. Установлено, что хроматографические компоненты сличительных Hb отличаются по скорости преобразования нитрит-аниона до NO (табл.).

Таблица. Скорость преобразования дезоксигемоглобина в нитрозогемоглобин (10-4 М х с-1)

Хроматографические фракции гемоглобина

Показано, что афинность минорных компонентов исследуемых Hb к кислороду выше по сравнению с мажорными. Установленные особенности функций компонентов гетерогенной системы Hb составляют основу формирования мультипараметрических режимов поставки газов в дышащие ткани согласно регионарным запросам и функционирования определённых звеньев цNо при условиях системных сдвигов в кровотоке при транзиторной гипоксии.

Влияние гипоксической гипоксии на систему
транспорта и депонирования кислорода

Популяционный спектр эритроцитов периферической
крови при условиях гипоксической гипоксии.

При сравнении К4/6 (К4/6 – относительное содержание клеток 4-й и 6-й фракций, которые размещаются в зонах 18- и 10% сахарозы соответственно) в динамике адаптации животных к гипоксической гипоксии обнаруживается неоднозначность ответа по этому показателю в подопытных группах животных.

В крови ондатр К4/6 достигает максимального значения в 2.06 на пятый день адаптации к гипоксии, резко снижается на 7-й день тренировки к гипоксии и приближается к исходным значениям на 40-й день адаптации, тогда, как в норме, в крови крыс К4/6 составляет 0.67. В процессе тренировки животных к гипоксии К4/6 возрастает и достигает максимума после второго дня адаптации и уменьшается до 0.27 на седьмой день действия гипоксического фактора.

 На 27-е сутки адаптации этот коэффициент достигает значения 0.51 и остаётся в этих пределах включительно до 40-го дня влияния гипоксического фактора. Изменения соотношения 4-й и 6-й фракций эритроцитов определённой мерой обусловлены возрастными особенностями популяционного состава красных клеток.

Резкое увеличение К4/6 в первые дни влияния гипоксии на животный организм, очевидно, обусловлено высвобождением депонированных эритроцитов, а также незрелых форм клеток костного мозга под действием стрессового фактора.

Уменьшение же К4/6, обусловлено выходом в периферийную кровь молодых клеток, что подтверждается данными о содержании креатина в эритроцитах, что отображает степень омоложения клеток. На третьи и двенадцатые сутки адаптации к гипоксии содержание креатина в эритроцитах вновь возрастает до 2.06±0.24 и 4.63±0.44 соответственно, по сравнению с контролем 1.66±0.33 мкмоль/100 мл эритроцитов.

Гетерогенная система гемоглобина при условиях гипоксии

Продолжительное действие гипоксического фактора сопровождается стабильным возрастанием содержания электрофоретических фракций Hb, у которых есть свойство ассоциироваться с мембраной эритроцита, и они характеризуются относительно высокой афинностью к О2 (р50 22.0±0.1 mm Hg), низким коэффициентом Хилла (n=1.50±0.Cool и по пероксидазной активности превышают цитозольный Hb в 2.4 раза.

Установлено, что в процессе адаптации к гипоксии количественные изменения компонент гетерогенной системы Hb сопровождаются и изменениями их физико-химических свойств. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей (Стародуб, 1982), относительно влияния ряда физико-химических факторов на систему Hb.

Индуцированная гипоксическим фактором гемоглобинизация эритроцитов онтогенетически ранними формами Hb способствует переходу от краткосрочной к долговременной фазе адаптации организма к гипоксии, поскольку для фетальных форм Hb характерно относительно низкое сродство к эндогенному NO, генерация которого усиливается в случае гипоксических состояний организма.

Сродство дезоксиHb к NO в 1.4 раза меньше для минорных компонент Hb крысы, которые представлены тетрамером типа α2β2с (Стародуб М.Ф. и соавт.,1979, Стародуб М.Ф.,1982), в сравнении с нефракционированным Hb.

Показано, что гипоксия инициирует функциональные изменения  компонент Hb. На фоне общего угнетения нитритредуктазной активности Hb при условиях гипоксического стресса имеет место уменьшение её интенсивности для мажорных и тенденция к увеличению её для минорных компонентов Hb. Установленные особенности функций компонентов гетерогенной системы Hb составляют основу формирования мультипараметрических режимов функционирования определённых звеньев цNО при условиях системных сдвигов в кровотоке при транзиторной гипоксии.

Кислородосвязывающие свойства гемоглобина при условиях гипоксии.

Одноразовое пребывание животных в условиях недостатка О2 во вдыхаемом воздухе, индуцирует левосторонний сдвиг КДК и увеличение сродства Hb к О2 (рис. 3).

Установлена видовая специфичность в интенсивности увеличения сродства Hb к О2 и в характере размещения КДК в участке верхней и нижней инфлексии. Для Hb вторичноводных амниот характерно относительно меньшее смещение р50 в сторону низких рО2  по сравнению с наземными животными.

Особенностью Hb у животных, стойких к недостатку О2, является более выраженное смещение КДК вправо в участке как нижней, так и верхней инфлексии кривой оксигенации. На кратковременный недостаток О2 наземные животные отвечают смещениям КДК влево и вверх в участке верхней и вправо в участке нижней инфлексии.

Рис. 3. Усреднённые КДК Hb крыс в норме (1) при одноразовом влиянии гипоксии (2), при адаптации к гипоксии (3); 1*, 2*, 3* – соответственно для гемоглобинов ондатр (А), кривые Литарчика (Б).

Левосторонний сдвиг КДК Hb обусловлен модификацией его оксидом азота, генерация которого увеличивается при условиях гипоксических стрессов, о чём свидетельствует уменьшение содержания предшественника NO – L-аргинина в плазме крови с 11.71±0.849 нмоль/0.1 мл в контроле до 6.634±0.591 нмоль/0.1 мл при гипоксии, а также прямые эксперименты по исследованию генерирования in vitro NO на КДК Hb.

Установлено, что при pNO 1.5 mm Hg в сатураторе, где помещается Hb, р50 сдвигается в сторону низких рО2. Показано, что инкубация Hb с МДА приводит к уменьшению р50 с 25.00±0.9 до19.05±0.8 mm Hg. Итак, при условиях гипоксического стресса в результате активации ПОЛ малоновый диальдегид инициирует левосторонний сдвиг КДК оксиHb в область низких рО2, повышение сродства Hb к кислороду.

Пероксидазная и нитритредуктазная активность гемолизатов эритроцитов
периферической крови крыс в динамике адаптации к гипоксии

Установлено, что одноразовое влияние гипоксического фактора сопровождается незначительным снижением пероксидазной активности Hb гемолизатов полученных из фракции стареющих эритроцитов. Для Hb из гемолизатов нефракционированных и фракций молодых эритроцитов характерно резкое угнетение пероксидазной активности на вторые сутки периодического прерывистого влияния гипоксии.

Такая тенденция прослеживается до седьмых суток адаптации. На девятые сутки во фракции стареющих эритроцитов пероксидазная активность достигает наивысшего значения и дальше остаётся без изменений на протяжении всех исследуемых сроков адаптации.

Аналогичная закономерность прослеживается для Hb нефракционированных и популяции “молодых” эритроцитов к девятым суткам адаптации. Изменения пероксидазной активности в процессе адаптации к недостатку О2 согласуется с результатами нитритредуктазной активности Hb, которая уменьшалась под влиянием гипоксического фактора с 3.81±0.08 до 3.15±0.05 (Hb крысы) и 2.32±0.3⋅10-4с-1 (Hb ондатры).

Влияние гипоксии на биосинтез миоглобина в тканях разных органов

Из радиоавтографов (рис. 4) видно, что в мышцах на второй день пребывания крыс в барокамере, где создавался недостаток рО2, что соответствует 7000 м н.у.м., количество Mb мРНК уменьшается.

Рис. 4. Радиоавтографы гибридов кДНК миоглобинового гена с суммарными поли-А-РНК мозга (1), скелетных мышц задних конечностей (2), печени (3) и почек (4) крыс.

Продолжительное влияние гипоксического фактора инициирует увеличение Mb мРНК в мышцах. Эти данные коррелируют с содержанием Mb в миоцитах. Так, если у интактных животных концентрация Mb составляет 0.3±0.02 мг/г сухой мышцы, то при кратковременном периоде адаптации к гипоксии его количество уменьшается до 0.18±0.05 мг/г сухой ткани.

На 55-й день тренировки к недостатку О2 содержание Mb в мышцах возрастает до 0.61±0.02 мг/г. В мозге 55-дневная тренировка к гипоксии вызывает стабильное увеличение Mb мРНК, наоборот, в печени и почках количество Mb мРНК на 55-е сутки адаптации к гипоксии несколько меньше по сравнию с нормой.

Интенсивность радиоактивного сигнала уменьшена в гибридизационном материале с концентрацией поли-А-РНК от 0.1 до 10мкг, а начиная с 0.01 до 0.001мкг радиоактивный сигнал исчезает полностью. Выявленные органные отличия синтеза Mb мРНК, в разные фазы формирования адаптивной реактивности организма к гипоксической гипоксии, отражают особенности характера направленного распределения О2, индуцированного гипоксией между органами и тканями.

Итак, экспрессия Mb генов в процессе адаптации животных к гипоксии происходит в соответствии с органоспецифическими потребностями в О2 и способствует компенсации гипоксического состояния.

Влияние гипоксической гипоксии на энергетический обмен в митохондриях печени

Показано, что скорость нефосфорилированного дыхания (V2) при окислении экзогенного сукцината МХ печени крыс возрастает с 18.3±1.0 до 24.2±1.4 нг-атом О на мг белка, дыхательный контроль (ДК) по Чансу после первого сеанса гипоксии увеличивается с 3.30 до 4.40. В то же время при окислении α-кетоглутарата (α-КГ) скорость нефосфорилирующего дыхания почти не изменяется.

Вместе с тем в МХ печени ондатр не наблюдали увеличения V2 при окислении сукцината. ДК увеличивался с 1.57 в норме до 2.15 при гипоксии. Похоже как и с МХ крыс в органеллах ондатр, начиная с третьего дня адаптации к гипоксии, прослеживается постепенное увеличение использования α-КГ.

Итак, продолжительное действие гипоксического фактора сопровождается снижением активности сукцинатоксидазного пути окисления с переключением МХ на использование α-КГ.

Перекисное окисление липидов и антиоксидантная
система в условиях гипоксической гипоксии

Четырёхчасовое пребывание крыс в барокамере с низким рО2 инициирует увеличение содержания ТБК-позитивных продуктов в эритроцитах на 35% по сравнению с контролем. Стимулированная гипоксией липопероксидация происходит на фоне снижения активности антиоксидантных ферментов СОД и каталазы – на 50 и 25% соответственно.

Через 24 часа после одноразового влияния гипоксического фактора активность СОД приближается к норме, а активность каталазы увеличивается ещё на 17%. На третий день адаптации животных к гипоксической гипоксии уровень ТБК-позитивных продуктов нормализуется.

Противоположные изменения были отмечены в эритроцитах ондатры: активность каталазы возрастает на 21%, а количество МДА уменьшается на 16% в кратковременный период адаптации. Установленная неоднозначность ответа в исследуемых системах на гипоксический фактор у представителей разных экологических групп свидетельствует о наличии в организме вторичноводных амниот генетически закреплённого комплекса механизмов адаптации к гипоксии, в том числе возможности получение энергии за счёт дополнительного О2, который образуется в результате активации ферментативных звеньев антиоксидантной защиты и, прежде всего, каталазы.

Динамика содержимого метаболитов NO в процессе адаптации к гипоксии

Закономерности экскреции конечных метаболитов NO (NO2- + NO3-) в моче в динамике адаптации к гипоксии имеют видоспецифический характер и отражают особенности функционального состояния L-аргинин – NO системы (рис. 5).

В отличие от крыс в моче естественно резистентных к гипоксии ондатр, после одноразового пребывания в гипобарических условиях количество стабильных продуктов NO уменьшается по сравнению с исходными значениями. Этот факт свидетельствует о том, что у ныряющих млекопитающих развиты механизмы быстрого использования эндогенного NO через активацию NO2-/NО3- – редуктазных реакций.

Важным является то, что в норме у ондатр NOх выделяется в шесть раз больше, чем у крыс. В переходный период адаптации к гипоксии концентрация NOх в моче ондатр возрастает и приобретает максимальные значения на 15–й день действия прерывистого гипоксического фактора. Использование ингибитора ксантиноксидазы – аллопуринола – подтвердило, что главный вклад в генерацию NO в организме крыс при условиях гипоксии даёт нитритредуктазное звено цNо.

Рис. 5. Содержание NOх (NO2- + NO3-) в моче крыс (заштриховано) и ондатр в динамике адаптации к гипобарической гипоксии; к – контроль.

Итак, в системе быстрого реагирования организмов на гипоксический стресс первостепенную адаптивную роль играет NO, который образуется кислородзависимым путём восстановления эндогенных нитрит- и нитрат-анионов гемической компонентой системы транспорта газов и молибденсодержащей NADH-зависимой ксантиноксидазой.

Взаимосвязь между кислородтранспортной, кислородродобразующей и
антиоксидантными системами организма при условиях гипоксии

Результаты исследований структурно-функциональных перестроек в антиоксидантной и кислородтранспортной системах в динамике адаптации к гипобарической гипоксии свидетельствуют о том, что в ранний период адаптации к гипоксии увеличение сродства Hb к О2 предшествует уменьшению продуктов ПОЛ и восстановлению активности ферментов АОС (рис. 6).

Ход кривых, которые отображают динамику изменений в функциональном состоянии кислородтранспортной и антиоксидантной систем в динамике адаптации к гипоксии, свидетельствует о том, что гипоксический стресс ведёт к увеличению сродства Hb к О2, угнетению ферментов АОС, увеличению ТБК-позитивных продуктов.

Рис. 6. Изменения p50 HbО2 (1); активности каталазы (2); СОД (3); ТБК-позитивных продуктов (4) в эритроцитах крови крыс в динамике адаптации к гипоксии; 1', 2', 4' – соответствующие показатели в плазме крови ондатр.

В дальнейшем в процессе адаптации к гипоксии имеет место тенденция нормализации исследуемых показателей. Важно, что в отличие от наземных животных у вторичноводных амниот одноразовое влияние гипоксического фактора сопровождается незначительными изменениями параметров сродства Hb к О2, содержанию ТБК-позитивных продуктов и активацией каталазы в эритроцитах крови.

Обнаруженная неоднозначность ответа в исследуемых системах на гипоксический фактор у представителей разных экологических групп свидетельствует о наличии в организме вторичноводных амниот генетически закреплённого комплекса механизмов адаптации к гипоксии, в том числе возможности получения энергии за счёт дополнительного О2, что освобождается в результате активации ферментативных звеньев антиоксидантной защиты и прежде всего активности каталазы.

Выявлена тесная корреляционная связь между сродством Hb к O2 и функциональным состоянием МХ. Увеличение сродства Hb к O2 сопровождается активацией фосфорилирующего дыхания в изолированных МХ в случае использования сукцината. Вместе с тем сродство Hb к О2 является своеобразным триггером в формировании механизмов постепенного перехода МХ на использование α-КГ.

По мере адаптации к гипоксии в МХ печени подопытных животных происходит активация процессов окисления α-КГ, а характерное для раннего периода адаптации к гипоксии окисление сукцината угнетается. Именно в этот период происходит правосторонний сдвиг КДК, который способствует оптимальным поставкам О2 в дышащие ткани посредством упрощения его диссоциации из комплекса Hb-O2.

Итак, функциональная взаимосвязь между кислородтранспортной, кислородутилизирующей и АО системами является тем ключевым звеном в формировании механизмов резистентности организма к дефициту O2 в кратковременный период адаптации, когда преобладает действие стресс-активирующей реакции, и мобилизуются резервы предсуществующих наследственных цепей адаптации.

С исчерпанием этих резервов постепенно развиваются стойкие, продолжительные механизмы адаптации к гипоксии, в которых задействованы уже все системы организма. Активация свободнорадикальных реакций под влиянием гипоксического фактора является пусковым моментом в формировании механизмов взаимодействия между процессами окисления и транспортом О2.

МДА, образовавшийся в эритроцитах под влиянием гипоксического фактора, модифицируя Hb, переводит его в состояние высокого аффинитета к О2. В результате, при условиях гипоксии, возрастает мощность системы борьбы за кислород, и тормозятся процессы использования последнего в оксигеназных путях. Левосторонний сдвиг КДК, очевидно, есть одним из тех ранних механизмов адаптации к гипоксическим стрессам, в результате которых отсрочиваются процессы повреждающего действия продуктов ПОЛ.

Рис. 7. Динамика изменений р50 (1) и дыхательного контроля (ДК) митохондрий печени крыс с использованием сукцината (2) и α-кетоглутарата (3) в процессе адаптации к гипобарической гипоксии.

Итак, сбалансирование прооксидантно-антиоксидантного равновесия в условиях гипоксии формируется с участием тесно связанных между собой кислородтранспортной, антиоксидантной и кислородутилизирующей систем. Именно функциональная связь между этими системами является ключевым звеном адаптации организма к недостатку О2.

Коррекция нарушений в кислородтранспортной и кислородутилизирующей
системах в условиях гипоксии карнозином и его комплексом с цинком

Природный водорастворимый антиоксидант карнозин, локализованный вместе с Mb, проявляет антигипоксический эффект в условиях гемической гипоксии, которая индуцирована введением подопытным животным NaNO2; снижает интенсивность ЭПР-сигналов комплексов Hb-NO крови крыс (рис. Cool, что свидетельствует о способности дипептида регулировать процессы трансформации NO при условиях гипоксических стрессов.

Рис. 8. ЭПР спектры крови крыс, зарегистрированные при T=77K: после введения NaNO2 (1); после перорального введения карнозина (доза – 70 мг/кг массы животного) до нитритной интоксикации (2); после перорального введения карнозина (доза – 630 мг/кг массы животного) до нитритной интоксикации (3).

« Последнее редактирование: Мая, 29, 2018, 13:25:53 pm от Евгений Вериго » Записан

Страниц: [1]   Вверх
  Печать  
 
Перейти в:  

Powered by MySQL Powered by PHP Powered by SMF 1.1.21 | SMF © 2006-2008, Simple Machines Valid XHTML 1.0! Valid CSS!